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电感受态大肠杆菌TGl的制备
点击次数:721 发布时间:2013-03-07
 

[方法]
1.将大肠杆菌TG1种到基本培养琼脂板,37℃过夜。
2.将基本培养琼脂板上的大肠杆菌TGl再接种到含有15m1 2XTY培养基的100ml形瓶中。37℃振荡培养过夜。
3.用5ml夜培养的TGl接种到两个含500m1 2×Y培养基的2L有挡板锥形瓶中。在摇床中培养约1.5小时,直到A600接近0.5。
4.将菌液转移4个预冷离心瓶中(约250ml/瓶)。平衡后,置于冰上20分钟。
5.以3000g,4℃离心15分钟。使用前预冷所有转头。
6,弃去上清,并以起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约250m1)重悬每个锥形瓶中的细胞。所有溶液都应当新鲜配置。
7.再次以3000g,4℃离心15分钟。
8.以一半起始体积的冰冷lmmol/L Hepes溶液(约125ml)重悬每个锥形瓶中的细胞;此时可合并到两个离心瓶中。
9.再次以3000g,4℃离心15分钟。
10.以总体积为20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重悬所有细胞。
11.再次以3000g,4℃离心15分钟。
12.如果细胞不是新鲜使用而是储存,则需准备乙醇/干冰浴。
13.以总体积为2m1的10%甘油重悬细胞。
14.使用新鲜制备的细胞,或者用干冰浴等量分装冻存细胞②。在检测效率后,及时使用细胞(在1周内)。
用于电转化的DNA不得含有盐分。细菌/DNA混合物中如有盐分可导致电弧(一种短路)的形成,应加以避免。总体上,在70℃10分钟的热灭活步骤后,可使用2/Il标准连接液进行连接。为构建抗体文库,所用DNA必须使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或选择合适的试剂盒(例如Geneclean或Qiagen)进行纯化。

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