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Colony hybridization重组质体的检定
点击次数:904 发布时间:2013-02-19
 

方法步骤:
1) 前一天转形的培养皿,当菌落长至约0.5 mm 大小时,将培养皿移至4℃放置1 h。
2) 准备一张无菌的硝化纤维滤膜,以铅笔在边缘标上组别。
◆ 请戴手套后再拿取滤膜!
3) 打开培养皿盖子,以两支扁平镊子将滤膜两边夹住,轻轻覆盖在菌落上方,尽可能避免有气泡产生。
◆ 注意!滤膜覆盖上去后就不要再移动!
4) 等滤膜完全湿透后,以针头在滤膜边缘戳洞做记号 (至少做三个记号)。小心把滤膜掀起,菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG plate 上。盖上盖子,在37℃培养2~4 h,以诱导启动T5 promoter,表现其下游基因。原培养皿则置回37℃使菌落再长出。
5) 将培养皿盖子打开,培养皿移至充满chloroform 蒸气的干燥器中,置放30min。
6) 取一个空petri dish 或适当大小容器,加入20 mL lysis buffer。 把已经过chloroform 溶菌的滤膜浸入lysis buffer,在室温震荡30 min。
7) 将滤膜以PBS 浸洗摇荡10 min,再更换PBS 继续浸洗10 min。
8) 将滤膜浸于明胶NET 溶液中,室温摇荡1 h。
9) 滤膜以PBST 浸洗两次,每次10 min。
10) 一次抗体以明胶NET 溶液适当稀释,再将滤膜浸入,于室温摇荡1 h。
11) 滤膜以PBST 浸洗两次,继以PBS 浸洗一次,每次10 min。
12) 将滤膜置于二次抗体溶液中 (以明胶NET 稀释),于室温摇荡1 h。
13) 滤膜以PBST 浸洗两次,继以PBS 浸洗一次,每次10 min。
14) 以DAB 溶液进行呈色反应。观察呈色情形,当讯号可明显与背景区别时,将滤膜以水浸洗数次,以中止呈色反应。
15) 将滤膜置于滤纸或吸水纸上干燥后与原培养皿对照,标出有正反应的菌落位置。滤膜以胶膜护贝,避光贮存。
16) 选取数个正反应菌落,以划单一菌落的方式分别接种在LB/Amp plate 上,置37℃培养直至菌落长出。亦同时接种于3 mL LB/Amp 培养液,于37℃震荡培养过夜,以抽取质体,进行限制酶分析。

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