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制备用于抗原上选择的噬菌体抗体
点击次数:466 发布时间:2012-12-27
 

       抗体文库储存料中制备噬菌体。在开始实验之前,先用滴定法(在TYE/amp/glu平板上系列稀释铺板)计算每毫升抗体文库储存料中细菌的数目。在600nm(A600)处的某个特定吸光值下,抗体文库中细菌数目较未感染细菌数目低一些。这或许是因为含有质粒的文库细菌体积更大,或者是存在死细菌。一旦滴度与A600确定关系,吸光值即可用于细菌数目的计算。对于噬菌体的制备(文库救援),来自文库储存料的起始接种量应比文库容量大5倍。接种到培养基后,细菌浓度的A600不应超过0.05。采用文库容量5倍以上的细菌接种以确保它能呈现出文库中的所有成员。而培养起始的A600小于0.05,则可以确保辅助噬菌体加入前处于多倍增长期,以提高辅助噬菌体感染的有效性。用于救援的zui小培养体积必须根据文库容量和0.05的zui大起始A600值来确定。例如,含有1.0×l010个成员的抗体文库所需要的起始接种量为5.0×l0l0个细菌。因为1.0A600=1.0×109,为保证起始培养液A600值小于0.05,则需要1L的培养体积。此体积的培养液应平均分到两个含有250ml 2×TY/amp/glu培养基的2L锥形瓶中。葡萄糖会抑制pⅢ的表达,但允许纤毛的表达。

使用新鲜制备的噬菌体才会得到zui佳选择结果。这是因为即便在-80℃下保存,展示抗体也会随时间的推移而出现缓慢的蛋白水解。应用氯化铯梯度离心法纯化菌体,能显著降低蛋白的水解。这样纯化后,蛋白质会非常稳定。预期产量是每毫升原始培养液产生(1~5)×101l个噬菌体,而氯化铯纯化后产量会下降50%。

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